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血清沉淀说明

尊敬的各位老师：

纤维蛋白原一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，在温度、盐度及酸碱度变化时, 纤维蛋白原单体易于聚合成纤维蛋白多聚体而形成沉淀，且每次冻融过程，都会析出。 如您还有任何其它细胞培养问题，请致电技术支持专线：400 820 3979，谢谢您的支持和理解。

疑难现象	原因分析	处理方法
血清沉淀	⚫ 血清沉淀大多是纤维蛋白原凝集造成； ⚫ 在显微镜下观察短杆状或黑丝状； ⚫ 血清沉淀不会影响细胞的增殖与形态； ⚫ 所有品牌都有类似的现象	⚫ 血清化冻处理步骤：将血清由-20°C 取出，放到 4°C 溶解。 ⚫ 去除沉淀：可以分装后进行离心（5000rpm, 5min）， 将沉淀离心到管底，然后取上清液使用；可以配置完全培养基后， 进行 0.22um 滤膜过滤使用。

2022年3月1日

A 外泌体研究中，如果仍然使用胎牛血清培养细胞、通过收集上清液来提取外泌体，胎牛血清中大量的牛源外泌体将对实验分析造成极大的干扰。建议使用去外泌体血清（P/N:C3801-0050）培养细胞。关于血清正确使用及饥饿培养对细胞的影响请查阅：

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 负染电镜结果中外泌体的形态是那种明显的茶托样，边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果结构是没有膜结构的圆球形，很可能是脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。

A 裂解和不裂解都可以，建议裂解，裂解后蛋白浓度会更高。

A目前大部分文献中没有检测内参基因，个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测，从文献调研结果来看，外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，Western blot检测时可能会检测不到任何条带或者条带微弱。因此，更多的是用等蛋白定量校准样品间的差异。

A外泌体相关文献统计，排在前4位的检测指标为CD63、TSG101、CD9、CD81；接着检测较多的4个指标为Alix、HSP70、flotillin和Syntenin等。

然《MISEV 2018》并未提出可以特异性地表征外泌体的分子标记。仅列出了必须在所有外囊泡制剂中分析的三类标记物，以证明外囊泡（类别1和2）并评估其从常见污染物中的纯度（类别3）。
注：
类别1：跨膜或GPI锚定蛋白，质膜和/或胞内体上任何类型外囊泡的标志，如CD63、CD81、CD82、CD9等；
类别2：细胞溶质蛋白（cytosolic proteins ，真核细胞和革兰氏阳性细菌）或周质蛋白（periplasmicproteins，革兰氏阴性细菌），分析确定脂质双分子层结构，如TSG101、HSP70、ALIX等；

类别3：非外囊泡结构的主要成分，通常与外囊泡共同分离。主要用来评估外囊泡制剂的纯度，如血清、血浆中的脂蛋白。

即《MISEV 2018》要求外泌体标志物鉴定，至少2个阳性指标：CD9、CD63、CD81 三选一以及TSG101、HSP70、ALIX三选一，另外纯度鉴定再加阴性对照。

A无法明确哪种分离方法比较好，各有千秋，以下列出常用的外泌体分离方法：

超速离心法（差速离心和密度梯度离心）：操作繁琐，耗时长，分离外泌体纯度较高，但得率低，目前分离外泌体主流方法；

尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）：应用填充多孔聚合物微球的柱子，精确分离大小分子，操作简便，耗时短，分离外泌体纯度较高；

聚合物沉淀法：操作简便，耗时短，可能会同时分离非囊泡污染物（包括脂蛋白），分离外泌体纯度较低；

磁珠免疫法：通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体，免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点，是富集表征独特的外泌体的优选方法。但是此方法效率低，外泌体内含物的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验的进行。

组合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌体纯化试剂盒）纯化流程温和，无需高速离心，操作简便并且产物纯度高，分离出的外泌体完好无缺，适用于下游功能研究、WB验证、RNA分析等。

A Zetaview仪器的最佳检测区间是10^7 particles/ml，且有浓度检测下限，为10^5 particles/ml，一般进样量不少于2 ml；

无法准确建议送样量，检测需要量与样本本身浓度有关，样本浓，则用量小，反之则多，根据检测经验，样本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl时大多由于样本分泌量过低、提取失败或者对样本有过多稀释。

一般建议：送样量不低于30 µl。